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分子熒光光譜實(shí)驗(yàn)報(bào)告
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原子外層電子吸收光子后，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再回到較低能級(jí)或者基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長(zhǎng)的輻射，稱(chēng)為原子熒光。對(duì)于分子的能級(jí)激發(fā)態(tài)稱(chēng)為分子熒光，平時(shí)所說(shuō)的熒光指分子熒光。以物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度與濃度之間的線性關(guān)系為依據(jù)進(jìn)行定量分析及以熒光光譜的形狀和熒光峰對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)進(jìn)行定性分析的方法稱(chēng)為熒光分析法。在熒光分析中，將熒光分為自然熒光和人工熒光，本實(shí)驗(yàn)所述熒光為自然熒光，即無(wú)須經(jīng)過(guò)處理，當(dāng)受到激發(fā)光照射時(shí)就能產(chǎn)生熒光的現(xiàn)象。
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
理解并掌握熒光產(chǎn)生的機(jī)理。
學(xué)會(huì)測(cè)定不同濃度物質(zhì)溶液的熒光激發(fā)光譜和發(fā)熒光射光譜。
了解影響熒光產(chǎn)生的幾個(gè)主要因素。
二、實(shí)驗(yàn)原理
原子外層電子吸收光子后，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再回到較低能級(jí)或者基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長(zhǎng)的輻射，稱(chēng)為原子熒光。對(duì)于分子的能級(jí)激發(fā)態(tài)稱(chēng)為分子熒光，平時(shí)所說(shuō)的熒光指分子熒光。
1、產(chǎn)生過(guò)程（如圖1）
光吸收：熒光物質(zhì)從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。此時(shí)，熒光分子處于激發(fā)態(tài)。
內(nèi)轉(zhuǎn)換：處于電子激發(fā)態(tài)的分子由于內(nèi)部的作用，以無(wú)輻射躍遷過(guò)渡到低的能級(jí)。 外轉(zhuǎn)換：處于電子激發(fā)態(tài)的分子由于和溶劑以及其他分子的作用，以及能量轉(zhuǎn)移，過(guò)渡到低的能級(jí)
熒光發(fā)射：如果不以內(nèi)轉(zhuǎn)換的方式回到基態(tài)，處于第一電子激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)的分子將以輻射的方式回到基態(tài)，平均壽命約為10ns左右。
系間轉(zhuǎn)換：不同多重態(tài),有重疊的轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。
振動(dòng)馳豫：高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間。
2、光譜特性
激發(fā)譜：固定測(cè)量波長(zhǎng)(選最大發(fā)射波長(zhǎng)),化合物發(fā)射的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光波長(zhǎng)的關(guān)系曲線 。激發(fā)光譜曲線的最高處，處于激發(fā)態(tài)的分子最多，熒光強(qiáng)度最大。
發(fā)射譜：固定激發(fā)波長(zhǎng)，發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長(zhǎng)的關(guān)系。
1) Stokes位移：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。
2) 發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)：電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光。
3) 鏡像規(guī)則：通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱(chēng)關(guān)系。
4) 熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率。
去掉激發(fā)光以后，熒光強(qiáng)度并不是立即消失，而是以指數(shù)形式衰減。定義熒光強(qiáng)度降低到激發(fā)狀態(tài)最大熒光強(qiáng)度的1/e所需要的時(shí)間稱(chēng)為熒光壽命。熒光壽命是個(gè)很重要的參數(shù)，可以不再對(duì)熒光的絕對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)量。
熒光壽命方程：
Q為量子產(chǎn)率，為熒光發(fā)射速率，k為非輻射轉(zhuǎn)移速率,τn為熒光自然壽命、通常量子效率和波長(zhǎng)相關(guān)，但生化的熒光通常和波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。
3、影響熒光分析的幾個(gè)主要因素：
樣品溫度的影響：降低體系溫度可以提高熒光量子產(chǎn)額。 樣品的光化反應(yīng)：光化反應(yīng)使熒光強(qiáng)度降低。 雜散光干擾：散射光來(lái)自激發(fā)光溶劑分子的散射（瑞利散射）或被小顆粒或氣泡的散射。通過(guò)在發(fā)射單色儀前和激發(fā)單色儀后插入相應(yīng)的短波截止濾光片來(lái)消除。 溶劑的影響：增加溶劑的極性，有利于熒光的產(chǎn)生。 溶劑的拉曼散射光：當(dāng)溶劑具有拉曼活性時(shí)，在激發(fā)光長(zhǎng)波邊會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似熒光的拉曼散射峰。 樣品濃度效應(yīng)：濃度高時(shí)熒光強(qiáng)度下降，需要校正。 樣品污染的影響：輕微的污染都會(huì)影響測(cè)量的準(zhǔn)確度。 溶解氧的影響：溶解氧對(duì)一定樣品有明顯的熒光消光效應(yīng)（猝滅）。 pH值的影響：弱酸或弱堿分子和它們的離子在電子構(gòu)型上不同，是不同的型體，各具有特殊的熒光量子產(chǎn)額和熒光光譜
三、 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和裝置
激發(fā)單色儀將氙燈輸入的連續(xù)光譜分理出單色光輸出，作為激發(fā)光。激發(fā)光照射到樣品上，樣品發(fā)射的熒光則由發(fā)射單色儀進(jìn)一步分光并被光電倍增管PM2接收。PM1用于監(jiān)控氙燈光源光強(qiáng)起伏。通過(guò)分束器獲得激發(fā)光強(qiáng)起伏信號(hào)，并反饋到PM2電路中，這被稱(chēng)為光源補(bǔ)償系統(tǒng)。RF-5301PC型分光光度計(jì)的光學(xué)系統(tǒng)示于圖3。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、 制備樣品：配置不同濃度維生素B2溶液：5μg/ml，10μg/ml，15μg/ml，20μg/ml，25μg/ml各10ml；
2、 樣品的激發(fā)光譜特性：選擇400nm激發(fā)波長(zhǎng)，對(duì)樣品照射，然后掃描熒光發(fā)射波長(zhǎng)，檢測(cè)熒光發(fā)射峰值波長(zhǎng)。然后將單色儀固定于峰值波長(zhǎng)上，對(duì)激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，得到激發(fā)光譜圖像；
3、 樣品的發(fā)射光譜特性：激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)置在激發(fā)光譜的峰值波長(zhǎng)處，對(duì)被測(cè)樣品照射，掃描熒光發(fā)射波長(zhǎng)。
四、數(shù)據(jù)處理和分析
1、 維生素B2溶液濃度為5μg/ml
2、 維生素B2溶液濃度為10μg/ml
3、 維生素B2溶液濃度為15μg/ml
4、 維生素B2溶液濃度為20μg/ml
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